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取材:血液
血管性假血友病因子的測定原理:在含抗血管性血友病因子相關(guān)抗原(VWF∶Ag)抗體的瓊脂板中,加入一定量的受檢血漿(抗原),在電場作用下,定量的抗原在含定量抗體的瓊脂中泳動。在一定的時間內(nèi)出現(xiàn)抗原抗體反應所形成的火箭樣沉淀峰,該峰的高度與抗原濃度成正比,以此可以計算VWF∶Ag的量。此法為Laurell免疫火箭電泳法。
試劑:
(1)三羥甲基氨基甲烷(Tris)-巴比妥緩沖液(pH值8.8):巴比妥鈉4.88g,巴比妥1.235g,Tris2.890g,加水至1L。
(2)9g/L瓊脂糖:瓊脂糖0.9g,Tris-巴比妥緩沖液100ml。將瓊脂糖置于Tris-巴比妥緩沖液中,加熱溶解,乘熱用薄層棉花過濾后使用。
(3)血清:兔抗人VWF∶Ag抗血清。
(4)4.4mmol/L磷鉬酸溶液:磷鉬酸10g,加水至1L,溶解后用濾紙過濾使用。
(5)有機玻璃框:框內(nèi)徑8cm×8cm,厚1.5mm。
操作方法:
(1)取一定量VWF∶Ag抗血清,用三羥甲基氨基甲烷-巴比妥緩沖液稀釋10倍,另取5g/L瓊脂糖三羥甲基氨基甲烷-巴比妥緩沖液隔水融化,冷卻至56℃。然后將預溫至56℃的稀釋VWF∶Ag抗血清1∶60混合(視抗體效價而定),制成8cm×8cm、厚1.5mm的瓊脂板,距玻板一邊約2cm處打一排小孔,徑孔3mm,孔間距為5mm。
(2)將瓊脂板置于電泳槽內(nèi),孔朝陰極,用濾紙作鹽橋,用定量注射器吸取原血漿1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等不同倍數(shù)稀釋的健康人血漿各10μl,分別加入抗體瓊脂板小孔里。待檢血漿樣品用Tris-巴比妥緩沖稀釋1倍后,加入各樣品孔內(nèi)。每孔加量均為10μl。
(3)電泳條件:電泳110~150V,電流約5mA/塊板,時間18h,溫度低于15℃。
(4)電泳完畢,取出凝膠板浸于4.4mmol/L磷鉬酸染色液中20min以上,然后再放入生理鹽水中浸泡10min,即可見明顯火箭狀沉淀峰,也可用氨基黑按常規(guī)方法染色。
(5)染色后,用雙分規(guī)測量火箭電泳峰的高度(從加樣孔上緣到峰頂),將標準血漿5個讀數(shù),通過回歸方程得出標準曲線,然后求出各測定樣品VWF∶Ag的含量,再乘以稀釋倍數(shù)(×2),即樣品實際濃度。表示相當于正常血漿的百分率。
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