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本法分三個步驟,即抗原與抗體反應、B和F分離和放射性測定。
(1)抗原與抗體反應:將標本(非標記抗原)、標記抗原和抗血清順序定量加入小試管內(nèi),置室溫(15~30℃)作用24h,使其充分競爭結(jié)合。
(2)B、F分離:分離技術(shù)多種多樣,常用沉淀法。
①第二抗體沉淀法:又稱雙抗體法,在受檢抗原與第一抗體特異性反應后加入相應的第二抗體,使形成的抗原-第一抗體-第二抗體的復合物共沉,一經(jīng)離心即可使結(jié)合標記抗原B與游離抗原F分離。本法是特異性沉淀,分離完全,非特異性結(jié)合力低。但第二抗體用量較大,成本較高。此外血清濃度、抗凝劑的有無因素可在一定程度上影響結(jié)果。
②聚乙二醇(PEG)沉淀法:使蛋白質(zhì)處于等電點狀態(tài),水化層破壞而導致蛋白質(zhì)沉淀。本法優(yōu)點是PEG制備方便、價廉、分離快速,缺點是非特異沉淀物較多,分離不完全。
③第二抗體-聚乙二醇沉淀法:本法既有PEG法的快速沉淀優(yōu)點,且保持第二抗體特異性沉淀的作用,又減少第二抗體用量,并降低PEG濃度,使非特異沉淀物減少。
④活性炭吸附法:利用活性炭表面活性將小分子的游離部分吸附。如在活性炭表面涂上一層葡聚糖,使它表面具有一定孔徑的網(wǎng)眼,從而允許小分子游離抗原或半抗原逸入而被吸附,而大分子復合物則被排斥在外。在抗原與抗體反應后,加入葡聚糖-活性炭,放置5~10min,使游離抗原吸附在活性炭顆粒上,離心使顆粒沉淀,上清液中含有結(jié)合的標記抗原。
(3)放射性強度測定:B和F分離后,即可測定其放射性強度。測量儀器有兩類:液體閃爍計數(shù)儀(測β射線)和晶體閃爍計數(shù)儀(測γ射線)。計數(shù)單位是探測器輸出的電脈沖數(shù),單位為cpm(脈沖數(shù)/min)。
每次測定均需作一標準曲線圖,以標準抗原的不同濃度為橫坐標,以測到的相應放射性強度為縱坐標作圖。放射性強度可任選B或F,亦可采用計算值B/B+F、B/F或B/B0。標本應作雙份測定,取其平均值,在標準曲線上查出相應的受檢抗原濃度。
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