真菌性角膜炎檢查
診斷比較困難，必須與細(xì)菌性角膜潰瘍進(jìn)行鑒別。有農(nóng)業(yè)性眼外傷史，典型的臨床表現(xiàn)，是診斷的主要依據(jù)。再者，疑為真菌感染時，應(yīng)作角膜病變處刮片。將取下的壞死組織放于玻片上，滴5%氫氧化鉀一滴，覆蓋破片，立即鏡檢，尋找真菌菌絲。有條件時應(yīng)進(jìn)行真菌培養(yǎng)。
1.刮片檢查
(1)取材：
表面麻醉(最好應(yīng)用0.5%丙氧苯卡因，因該藥較其他表面麻醉劑的抑菌作用輕)后，用圓刃刀片從病灶深部或邊緣刮取組織。
(2)染色法：
常用的方法有革蘭染色法、Giemsa染色法及KOH濕片法，有時也可采用特殊真菌染色法(Gomori mefhenamine)，其染色的陽性率分別為55%、66%、33%及85%。革蘭染色最為簡單，真菌呈革蘭陽性(深紫色)，其他組織為陰性(紅色)。KOH濕片法是利用KOH溶解刮片中的非真菌雜質(zhì)而顯示菌絲，有報(bào)道同時加入亮綠、甲綠或墨水染色(10%氫氧化鉀和墨汁以9∶1的比率混合而成的混合液)能增加對比度，光鏡下可見真菌細(xì)胞壁有墨水或綠色小顆粒附著，而膠原纖維及炎性細(xì)胞則未著染，對比強(qiáng)烈，容易識別。缺點(diǎn)為易出現(xiàn)假陽性或假陰性。最近有人采用caleofluor-white染色(CFW染色)，此染色劑能與真菌細(xì)胞壁的殼多糖和纖維素緊密結(jié)合，在熒光顯微鏡下真菌顯示強(qiáng)烈的深綠色。
2.真菌培養(yǎng)
刮片檢查簡單而迅速，但只能確定是真菌，而不能鑒別真菌菌種及進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，因此，還必須進(jìn)行真菌培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)溫度如下。
(1)血瓊脂(blood agar)，25℃及37℃下培養(yǎng)。
(2)sabouraud葡萄糖瓊脂，25℃及37℃下培養(yǎng)。
(3)馬鈴薯葡萄糖瓊脂，25℃及37℃下培養(yǎng)。
多數(shù)酵母菌易在血瓊脂中生長，絲狀菌易在sabouraud瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂生長(注意鐮刀菌在37℃時，2～3天即可生長，而其他真菌在37℃時，則需要1周以上時間才能生長)。
3.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)
(polymerase chain reaction，PCR) 國外已有將臨床分離出的真菌進(jìn)行體外培養(yǎng)，并應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行分型診斷，認(rèn)為PCR技術(shù)對于角膜真菌的快速診斷有良好的應(yīng)用前景，但需要解決假陽性結(jié)果的問題。
4.應(yīng)用幾丁質(zhì)鑒別真菌
Lamps(1995)指出幾丁質(zhì)是在真菌和節(jié)肢動物中含有的多糖結(jié)構(gòu)，而在哺乳動物中缺乏。真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)成分隨著菌種的不同而不同，因此具有很高的特異性，不同熒光標(biāo)記的凝集素可以與不同幾丁質(zhì)特異性結(jié)合，發(fā)出特異熒光，以快速診斷并鑒別菌種。國外目前認(rèn)為此技術(shù)為快速特異的真菌診斷手段，國內(nèi)尚未見報(bào)道。
5.角膜活檢
當(dāng)刮片和培養(yǎng)均為陰性結(jié)果，臨床仍然懷疑真菌感染時除應(yīng)反復(fù)多次進(jìn)行檢查外，還應(yīng)做角膜活檢。用尖刀片切取病灶組織，或用穿透性角膜移植術(shù)鉆取的病灶組織，石蠟包埋固定后作病理切片，然后染色鏡檢。光鏡檢查的染色法有：PAS染色，HE(蘇木精-伊紅)染色及抗酸染色等;熒光顯微鏡檢查有吖啶橙(acridine orange)染色及CFW染色。組織學(xué)上所見：
(1)“菌絲苔被”
是由大量中性粒細(xì)胞浸潤、角膜基質(zhì)層的凝固性壞死及膠原纖維腫脹所構(gòu)成，很少見到完整的真菌。
(2)菌絲苔被病灶周圍有大量菌絲，
菌絲沿角膜板層平行蔓延，也可垂直穿通角膜小板向前向后生長，并穿過后彈力膜到達(dá)前房或后房引起炎癥反應(yīng)。
(3)“羽毛狀邊緣”
是圓形細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤，并非是真菌的菌絲。
6.共焦顯微鏡(confocal microscope)
共焦顯微鏡是20世紀(jì)90年代中期新興的一種活體非創(chuàng)傷性的角膜疾病檢查方法，可以從細(xì)胞水平觀察角膜的不同層次結(jié)構(gòu)。已應(yīng)用于HSK和棘阿米巴角膜炎的診斷。Winchester(1997)應(yīng)用共焦顯微鏡觀察曲霉菌性角膜炎，角膜中可見高清晰度的菌絲直徑6微米，長60～40微米。在時間、敏感性、安全性方面，共焦顯微鏡都明顯優(yōu)于以往任何一種診斷方法。
